酶联免疫吸附测定法（ Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay ；也称 ELISA ）用特异性抗体或抗原捕获样品溶液中所含的目标抗原或抗体，利用酶反应来捕获目标抗原或抗体样品溶液中所含的物质，这是一种检测和定量的方法。

利用抗原抗体反应的各种组合，通过将酶标记的抗原或抗体掺入反应体系中，最终检测酶活性为了检测酶活性，使用吸收光谱根据反应而变化的底物，并通过吸光度测量来定量。 根据抗原抗体反应的组合方式，有直接法、间接法、夹心法、竞争法等方法 。

直接法

直接 ELISA （酶联免疫吸附测定）是一种基于板的免疫吸附测定，在检测和定量特定分析物（例如抗原、抗体、蛋白质、激素、肽等）来自复杂的生物样品。在四种不同的 ELISA 格式中，直接 ELISA 是最简单、执行速度最快的方法，但该方法也存在一些缺点（参见表 1 ）。

在直接 ELISA 中（图 1 ），抗原直接固定在多孔微量滴定板的表面，例如 96 孔聚苯乙烯板，然后与抗原特异性的酶标记一抗复合。一旦酶标记的一抗与抗原结合，缀合的一抗就会催化与其各自底物的反应，产生可见的比色输出，并通过分光光度计或吸光度酶标仪进行测量。直接 ELISA 适用于目标样品中的定性和定量抗原检测、抗体筛选和表位作图。

图 1. 说明直接 ELISA 的设置：

1. 通过被动吸附将抗原固定在 96 孔聚苯乙烯板的孔上。

2. 将针对目标抗原特异的酶标记一抗（例如 HRP 标记一抗）添加到孔中并直接与抗原结合。

3. 添加相应的酶底物（例如 TMB(11012) ，一种适合 HRP 的底物），与酶反应后，产生可以通过分光光度计或吸光度酶标仪测量的可见比色输出。

优点：

•需要更少的试剂和更少的步骤，使这种 ELISA 格式简单快速，同时最大限度地减少潜在的用户错误

•消除二抗的交叉反应性

缺点：

•抗原固定不具有特异性，导致潜在的高背景干扰

•一抗必须单独标记，既耗时又昂贵

•无信号放大

•灵活性低——每种靶蛋白都需要特定的偶联一抗

•一抗的免疫反应性可能会受到酶标记的不利影响

间接法

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 可以通过对其基本方案进行各种修改来完成。例如，直接 ELISA 使用酶标记一抗缀合物来检测固定化抗原。然而，由于它只是 1:1 的化学计量比，因此放大或提高信号强度以方便或读取以及更精确的测量是不可能的。

间接 ELISA 在基线直接 ELISA 过程的基础上又增加了一个步骤。选择的抗原与实验表面结合，并添加对其具有特异性的未标记一抗并与抗原结合。随后，添加酶标记的二抗并与一抗结合。这不仅提供了可定制的信号，而且使特定实验的过程具有更大的适应性，因为二抗可以针对多个一抗。将无色底物引入样品中，与酶缀合物发生反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色、化学发光或荧光的。

研究人员在决定实验方案中包含哪种检测时必须考虑多个标准。下表列出了间接 ELISA 权衡的一系列因素。

图2说明比色间接 ELISA 的设置：

1. 用测试抗原包被 ELISA 板，密封板并在 4°C 下孵育过夜

2. 除去包被溶液并用所需缓冲液洗板 2 次

3. 用所需的封闭溶液在 4°C 下封闭板 1 小时

4. 用缓冲液洗板 2 次

5. 与未偶联的一抗在室温下孵育 1 小时

6. 用缓冲液洗板 4 次

7. 与 HRP 标记的二抗（在封闭缓冲液中）在室温下孵育 1 小时

8. 用缓冲液洗板 4 次

9. 用 ReadiUse™TMB 底物溶液（货号 11012 ）在室温下孵育板 15-30 分钟。

10. 使用 Signal Guard™HRP 反应终止液终止反应（货号 11020 ）

11. 使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号

优点：

•易于获取——多种预标记二抗可供选择

•经济–需要更少的标记抗体

•高灵敏度–一抗含有多种表位，可结合多种标记二抗，从而导致信号放大

•非常灵活–单个二抗可用于检测不同的一抗

•保留一抗的最大免疫反应性

•不同的可视化标记物可以与相同的一抗一起使用（例如生物素 / 链霉亲和素）

缺点：

•二抗的潜在交叉反应，导致非特异性染色

•与直接 ELISA 格式相比，实验方案更长，因为该过程需要额外的孵育步骤

三明治法

三明治 ELISA 是许多研究应用中最受欢迎的检测选择，它是独一无二的。虽然它也像间接 ELISA 一样使用两种抗体与目标抗原结合，但其中一种抗体将首先用于包被实验表面。微孔板彻底包被后，将目标抗原添加到样品孔中并与第一抗体结合。然后将第二个抗体添加到微孔板中并与目标抗原结合，从而有效地将目标蛋白 “ 夹在 ” 两个抗体之间。该测试具有高度特异性、高度灵敏性，并且具有不需要任何形式的样品纯化的优点，因为只有目标抗原会受到两种抗体的影响，从而能够获得出色的分析物浓度实验读数。然而，寻找合适配对抗体的费用和困难是主要的缺点。

竞争法

竞争 / 抑制 ELISA 解决了从与任何其他检测版本相反的方向测量样品中分析物浓度的问题。首先，使用已知抗原包被微孔板样品孔。其次，添加测试样品材料，最后引入酶标抗体以检测结果。由于测试分析物与酶标抗体 “ 竞争 ” 结合，因此分析物的存在将降低与其浓度相称的信号输出。这种反向方法还允许测试未知样品而无需纯化，并且适用于广泛的实验。该技术的复杂性和难度与间接或夹心 ELISA 方案在时间和费用方面相似。

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